Oggi le tecnologie diagnostiche molecolari si stanno evolvendo a un ritmo senza precedenti, con progressi significativi negli ultimi due anni. Tra questi, le tecnologie di amplificazione isotermica hanno attirato più attenzione a causa della loro capacità di eseguire l'amplificazione senza la necessità di attrezzature specializzate. Esistono diversi metodi di amplificazione isotermica noti, come lampada, RPA e RAA. Tuttavia, oggi voglio introdurre una nuova tecnologia di amplificazione isotermica-mira.
Per garantire che tutti abbiano una comprensione coerente dei concetti chiave, ecco alcune spiegazioni a termine:
- Amplificazione della ricombinasi polimerasi (RPA): questa è una tecnologia di amplificazione mediata dalla ricombinasi.
-Amplificazione assistita dalla ricombinasi (RAA): un simile metodo di amplificazione mediata dalla ricombinasi.
- Amplificazione isotermica mediata da loop (lampada): un'altra tecnica di amplificazione isotermica.
- Amplificazione rapida isotermica multienzima (mira): una nuova tecnologia di amplificazione rapida isotermica.
Riepilogo rapido e chiarimenti:
Molti potrebbero chiedersi quale di questi vari metodi di amplificazione isotermica sia più affidabile e stabile. In realtà, ogni tecnologia ha i suoi punti di forza e limitazioni. Tuttavia, i fattori chiave per l'adozione di successo sono la capacità di ridimensionare la produzione in modo affidabile, a basso costo e prestazioni robuste tra diverse applicazioni.
Ora analizzerò brevemente ogni tecnologia in base a ciò che so:
Lampada (amplificazione isotermica mediata da loop):
Molti sul campo sanno che la lampada ha avuto origine in Giappone, sviluppata dal Dr. Notomi nel 2000 come una nuova tecnica di amplificazione genica. Attualmente, la proprietà di questa tecnologia appartiene alla società giapponese Eiken Chemical Co., Ltd.
Vantaggi:
- alta sensibilità (2-5 ordini di grandezza superiori ai metodi PCR tradizionali).
- breve tempo di reazione (le reazioni possono essere completate in 30-60 minuti).
- Non è necessario strumenti speciali in uso clinico (sebbene sia raccomandato un torbidimetro in tempo reale durante lo sviluppo del kit).
- Facile da usare (che rileva il DNA o l'RNA, il processo prevede la miscelazione della soluzione di reazione, degli enzimi e del modello in un tubo di reazione, quindi incubando a circa 63 gradi per 30-60 minuti in un bagno d'acqua o incubatrice, con risultati osservabili dall'occhio nudo).
Svantaggi:
- L'elevata sensibilità può comportare la contaminazione dell'aerosol una volta aperta il tubo, rendendolo inadatto all'uso al di fuori di un laboratorio PCR a causa di un alto rischio di falsi positivi.
- Il design del primer è impegnativo, rendendolo inadatto per alcune malattie, in particolare quelle causate da virus con poche sequenze comuni.
- La sua applicazione è relativamente limitata.
Tecnologie di amplificazione isotermica RPA e RAA:
Questi due metodi sono in gran parte omologhi, con la differenza principale la fonte della ricombinasi utilizzata.
- La ricombinasi di RPA proviene dal batteriofago T4.
- La ricombinasi di RAA deriva da batteri o funghi.
Punti chiave del principio di lavoro:
1. In presenza di ATP, la ricombinasi si lega ai primer, formando un complesso di acido proteina-nucleico, che cerca quindi il DNA bersaglio corrispondente.
2. Una volta che il primer trova il modello di DNA corrispondente, l'idrolisi ATP fornisce l'energia per la ricombinasi per lasciare il primer e il DNA polimerasi sintetizza un nuovo filamento di DNA.
3. Allo stesso tempo, le proteine leganti il DNA a singolo filamento (SSB) si legano al filamento di DNA spostato per prevenire la riforma del doppio filamento.
Vantaggi:
- La reazione RPA/RAA è molto veloce, con risultati realizzabili in circa 30 minuti.
- La sensibilità può raggiungere 10 copie/μL.
- Non è necessario attrezzature complesse durante l'amplificazione.
-L'ulteriore sviluppo di metodi di cromatografia d'oro a base di sonda o colloidali semplifica notevolmente l'interpretazione dei risultati, rendendoli adatti all'uso in aree a risorse limitate o economicamente svantaggiate.
Svantaggi:
- RPA è una tecnologia sviluppata dalla società britannica Twistdx, che ora è di proprietà di Abbott, con conseguenti costi elevati, lunghi cicli di approvvigionamento e mancanza di supporto tecnico. Ciò rende difficile l'applicazione su larga scala e la produzione di massa in Cina.
- La RAA è una tecnologia puramente domestica, ma manca di stabilità in termini di resistenza alle interferenze e coerenza del reagente del prodotto. Inoltre, il processo di produzione per gli enzimi funzionali necessita di miglioramenti. Sebbene la tecnologia sia sul mercato da cinque anni, non è stata ancora ampiamente adottata a causa di problemi di stabilità e versatilità.
- Sia RPA che RAA richiedono primer che sono in lunghezza 30-35 bp. Primer più brevi influenzano la specificità, la sensibilità e la velocità di amplificazione, rendendo impegnativo il design del primer.
Mira (amplificazione rapida isotermica multienzima):
Mira è una nuova tecnologia di amplificazione isotermica introdotta a metà -2019. È omologa a RPA e RAA.
Sebbene Mira condivida somiglianze con RPA e RAA in termini di principi di lavoro, ci sono differenze significative nella selezione degli enzimi, nella coltivazione, nella purificazione e in altri aspetti della produzione su larga scala. Inoltre, il team tecnico dietro lo sviluppatore di Mira, Ampfuture, ha trascorso quasi 11 anni a perfezionare la tecnologia. Ora è completamente attrezzato per supportare lo sviluppo di reagenti pronti all'uso, sviluppo personalizzato, progetti di ricerca e altri servizi personalizzabili.
Vantaggi:
1. Le proteine funzionali nei reagenti MIRA provengono da vari enzimi, con alcuni enzimi sottoposti a modifiche mirate per migliorare l'efficienza del sistema di enzimi centrali, risultando in un sistema più completo.
2. Forte resistenza alle interferenze e stabilità. I reagenti Mira subiscono un'ottimizzazione ampia in termini di selezione e concentrazione di cofattori, insieme ai processi di produzione di liofilizzazione, rendendoli più resistenti alle interferenze e più stabili.
3. Personalizzazione e versatilità. A causa del controllo completo sulla produzione di proteine funzionali e una profonda comprensione della tecnologia, Mira può essere adattata a varie applicazioni, offrendo diversi sistemi di reagenti e servizi di personalizzazione personalizzati.
4. Brevetti proprietari. Poiché Mira è sviluppato al 100% a livello nazionale, non vi è alcun rischio di violazione dei brevetti durante lo sviluppo del prodotto. Ciò offre a Mira un vantaggio competitivo sia nei mercati nazionali che internazionali.
5. È stato stabilito un protocollo di produzione completo, consentendo una produzione su larga scala stabile.
Svantaggi:
1. Il riconoscimento del mercato è ancora basso e sono necessari più dati e riferimenti da diversi campi (come tassi positivi in diverse aree) per ottenere un'accettazione più ampia.
2. Il design del primer segue ancora le caratteristiche di RPA o RAA, che richiedono sequenze di primer o sonda più lunghe, che potrebbero non facilitare un passaggio rapido per gli utenti PCR attuali.