Lo Staphylococcus haemoliticus è un batterio negativo a coagulasi gram-positivo che è molto comune negli ospedali. Negli ultimi anni, c'è stata una crescente preoccupazione a causa dell'elevato rischio di infezioni acquisite in ospedale. Lo Staphylococcus haemoliticus può causare ulteriormente infezioni cutanee, meningite, peritonite e persino sepsi. I ritardi nella diagnosi clinica possono portare al deterioramento delle condizioni di salute, quindi la diagnosi rapida dello Staphylococcus haemolyticus è la chiave per un trattamento preciso.
Il gruppo di ricerca del professor Ji Tuo del Dipartimento del laboratorio centrale dell'ospedale popolare di Lianyungang ha pubblicato un articolo "Una rilevazione rapida e visiva di Staphylococcus haemoliticus in esemplari clinici con mira-LFS" nella rivista "Analytica Chimica Acta", con un fattore di impatto di 6.2.
Panoramica dello studio
In questo studio, il gruppo del Prof. Ji Tuo ha stabilito un metodo per la rilevazione di Staphylolyticus haemolyticus da parte di mira-LFS basato sul gene MVAA e ha utilizzato la tecnologia di amplificazione nucleica rapida a temperatura costante multi-enzimatica Mira combinata con LFS di test di flusso laterale per raggiungere un rapido rilevamento del patogeno. L'esperimento è stato eseguito a 37 gradi e i risultati sono stati rilevati entro 9 minuti con una sensibilità di rilevamento di 0. 147 CFU/reazione. Il metodo di rilevamento di mira-LFS è adatto per il rilevamento a punto fisso di Staphylococcus haemolyticus in campioni clinici e realizza il metodo di identificazione dello Staphylococcus haemoliticus da parte di POCT, che ha un grande valore per la diagnosi rapida e il trattamento delle malattie in aree non servite. Il gruppo di ricerca ha utilizzato MIRA-LFS, QPCR e metodi tradizionali di coltura batterica per analizzare 95 campioni clinici casuali e ha confermato l'applicabilità clinica.
Metodi di ricerca
Un diagramma schematico del test Mira-LFS è mostrato sopra. In questo studio, sono stati utilizzati il kit di amplificazione rapida a temperatura costante di DNA di Ampfuture Biotech (tipo di striscia di prova dell'oro colloidale) e striscia di prova di rilevamento dell'acido nucleico.
La lunghezza del primer del gene MVAA era 30-35 nucleotidi e la lunghezza del prodotto di amplificazione era 100-350 bp e sono state progettate un totale di 6 coppie di primer candidati. Il GDNA dei ceppi di stafylococcus stafillitici standard è stato utilizzato per l'analisi MIRA, i primer candidati sono stati sottoposti a screening e i prodotti amplificati sono stati visualizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio al 2%.
(I prodotti di amplificazione vengono visualizzati utilizzando elettroforesi su gel di agarosio)
La sonda viene quindi progettata secondo la sequenza di primer in avanti (16 bp all'indietro). L'estremità 5 'della sonda è etichettata con FITC e l'estremità 3' è etichettata C3. Il nucleotide di posizione 31- nella sonda viene sostituito con THF a una distanza di 30 bp dall'estremità 5 'e 15 bp dall'estremità 3'. L'estremità 5 'del primer inverso selezionato è etichettata con biotina.
(Diagramma schematico di modifica incrociata e sequenza di combinazioni di primer-srobe)
Inoltre, sono state ottimizzate le condizioni di reazione per il rilevamento di mira-LF da Staphylococcus haemolyticus. I test vengono eseguiti a 37 gradi da 4-12 min ad intervalli di 2 minuti. I risultati sono mostrati nel tempo di reazione a 8 minuti e la linea di test è chiaramente visibile. Inoltre, il test viene eseguito da 22-52 gradi a intervalli di 5 gradi. Il grado 37-42 è la temperatura più adatta per il rilevamento di mira-LFS. Pertanto, il tempo di reazione e la temperatura ottimali del metodo Mira-LFS per Staphylococcus haemolyticus erano rispettivamente di 8 minuti e 37 gradi. Insieme al fatto che il risultato finale è visualizzato da LFS entro 1 minuto, il tempo di rilevamento totale è di 9 minuti.
(Ottimizzazione del tempo e della temperatura di reazione)
Risultati sperimentali
1. Verifica di sensibilità
Concentrazioni diverse di DNA genomico (GDNA) ottenute da diluizioni seriali delle colture di Staphylococcus haemolytica (1 0^6-10^0 cfu/ml) sono state testate per mira-LFS.
(Segnale positivo a diverse concentrazioni)
L'analisi di regressione dell'unità probabilistica ha mostrato che il LOD al 95% determinato dal test mira-LFS era 0. 147cfu/reazione.
(Limite di calcolo del rilevamento)
2. Convalida della specificità
La selettività del rilevamento di mira-LFS è stata determinata analizzando 18 ceppi di comuni microrganismi patogeni e 15 ceppi di Staphylococcus haemolyticus clinico. I risultati hanno mostrato che il test di mira-LFS era negativo per tutti e 18 gli altri batteri patogeni e positivo per 15 campioni clinici verificati di Staphylococcus haemolyticus.
(Sono stati testati 8 ceppi di batteri patogeni standard e 15 ceppi di streptococco emolitico clinico, rispettivamente)
Il test Mira-LFS ha un'alta selettività ed è adatto allo screening di Staphylococcus haemolyticus.
3. Test del campione effettivo
Un totale di 95 campioni sono stati raccolti casualmente dall'ospedale di Lianyungang Second People, tra cui 35 campioni di pelle e tessuto molle, 16 campioni di urina, 14 campioni di espettorato e 30 campioni di sangue.
(95 campioni clinici sono stati testati con diversi metodi)
I risultati hanno mostrato che il metodo di rilevamento era coerente al 100% con il metodo QPCR. Inoltre, rispetto al gold standard (GB/T4789. 11-2003), la sensibilità e la specificità del test mira-LFS per l'identificazione dell'infezione da Staphylococcus haemolytica erano rispettivamente al 100% e al 98,73%. Questi risultati convalidano ulteriormente la fattibilità tecnica del metodo nella rilevazione di Staphylococcus haemoliticus in campioni clinici.
Il metodo MIRA-LFS viene utilizzato per la rapida rilevamento di Staphylococcus haemolyticus da parte di POCT, che è efficiente, accurato, semplice ed economico, che è utile per la diagnosi rapida e le decisioni di trattamento.