L'Aeromonas hydrophila è un batterio patogeno importante nell'acquacoltura, che causa gravi malattie negli animali d'allevamento e comporta notevoli perdite economiche. Per consentire un rilevamento rapido in-sito, abbiamo sviluppato una piattaforma microfluidica portatile che integra l'amplificazione rapida isotermica multi-enzimatica (MIRA) con la gestione automatizzata dei fluidi. Il design del chip incorporava un motore di vibrazione in miniatura e cuscinetti riscaldanti in ceramica per mantenere
controllo preciso della temperatura e garanzia di omogeneità della reazione durante l'estrazione e l'amplificazione dell'acido nucleico. Una pompa ad aria in miniatura ha spinto l'estratto di DNA grezzo attraverso il chip in un'unica fase di pipettaggio per garantire la massima precisionequantificazione. Il DNA estratto è stato successivamente trasferito in una camera di reazione precaricata con MIRAreagenti per l'amplificazione isotermica a 39 gradi con monitoraggio della fluorescenza in tempo reale-. Questa piattaforma è stata rilevata
A. hydrophila in campioni di acqua entro 40 minuti, ottenendo un intervallo lineare da 1 × 10² a 1 × 10⁷ CFU⋅mL−1e un limite di rilevamento (LOD) di 10 CFU⋅mL−1. In particolare, il suo design modulare consente un facile interscambio di primer e sonde, rendendo la piattaforma facilmente adattabile per rilevare diversi agenti patogeni batterici in acquacoltura.
Confronto schematico tra la piattaforma microfluidica portatile e la piattaforma di rilevamento convenzionale per A. hydrophila. (A) La microfluidica portatile
piattaforma. Il flusso di lavoro di rilevamento su questa piattaforma integra l'estrazione dell'acido nucleico, il pipettaggio preciso, l'amplificazione e il rilevamento. (B) La piattaforma di rilevamento convenzionale. Il flusso di lavoro convenzionale-basato su laboratorio si basa su apparecchiature sofisticate, personale qualificato e procedure-intensive in termini di tempo.
Valutazione della stabilità della piattaforma microfluidica portatile. (A) Fotografia della piattaforma microfluidica portatile. (B, C) Prestazioni termiche delle camere di estrazione e rilevamento dell'acido nucleico. Relazione tra cuscinetto riscaldante in ceramica e temperatura della camera. (D) Stabilità del rilevamento della fluorescenza (N=3). L'intensità della fluorescenza è stata misurata a intervalli di 5 minuti durante tutto il processo di amplificazione.
Valutazione delle prestazioni della piattaforma microfluidica portatile. (A) Curva di calibrazione per il rilevamento di A. hydrophila (N=3). È stata stabilita una curva di calibrazione rilevando A. hydrophila in un intervallo di concentrazione di 1 × 101 –1 × 108 CFU⋅mL−1in condizioni ottimali. (B) Valutazione della riproducibilità da chip-a-chip. Il test MIRA per A. hydrophila è stato eseguito su dieci chip fabbricati da ciascuno di due stampi indipendenti. (C) Analisi della specificità (N=3). La specificità del test MIRA è stata convalidata rispetto all'A. hydrophila target e a 11 specie batteriche non-target. (D) Confronto con qPCR (N=3). Sia la piattaforma che la qPCR sono state utilizzate per rilevare A. hydrophila a varie concentrazioni. (E) Rilevazione di ceppi isolati sul campo- (N=3). Sono stati rilevati quattro ceppi di A. hydrophila isolati sul campo-utilizzando sia la piattaforma che la qPCR.