Qui, stabiliamo sCRAM (motivo adiacente protospaziatore subottimale (PAM)-mediato da RNA CRISPR e nucleasi Cas12a combinati con amplificazione rapida isotermica multienzimatica), una piattaforma diagnostica rapida e priva di estrazione-che rileva la PSA entro 20 minuti. sCRAM integra una fase di rilascio rapido dell'acido nucleico (40 gradi, 5 minuti) con una reazione in un-tubo che combina l'amplificazione isotermica multienzimatica (MIRA) e un PAM subottimale-mediato CRISPR/
Sistema Cas12a (37 gradi, 15 min), che consente la lettura visiva-senza strumenti tramite luce UV o strisce a flusso laterale (LFS). sCRAM dimostra sensibilità di rilevamento di copie singole-e non mostra alcuna reattività incrociata-con cinque comuni agenti patogeni dei suini (PRRSV, PPV, JEV, PCV e PRV). La valutazione di 111 campioni clinici e simulati (inclusi sangue, plasma e tamponi) ha rivelato una concordanza del 100% con qPCR per la lettura UV e del 98,20% per LFS
lettura, con entrambi i metodi che mostrano una specificità del 100%. La semplicità, la velocità e l'adattabilità sul campo della sCRAM ne sottolineano il potenziale per la sorveglianza decentralizzata della PSA in contesti con risorse-limitate, offrendo un potente strumento per il contenimento dell'epidemia.
In questo studio, abbiamo sviluppato sCRAM, una piattaforma di rilevamento della PSA rapida e implementabile sul campo che integra CRISPR/Cas12a mediato da PAM subottimale con amplificazione isotermica multienzimatica. Il test raggiunge una sensibilità singola-copia di 1 copia/μL entro 20 minuti e non mostra alcuna reattività crociata-con i principali agenti patogeni suini. La convalida clinica su campioni di sangue, plasma e tamponi ha dimostrato piena concordanza con qPCR utilizzando la lettura della luce UV e un'accuratezza del 98,20% tramite strisce a flusso laterale. Grazie al funzionamento semplificato, all'elevata sensibilità e specificità e all'interpretazione visiva dei risultati, la sCRAM offre un forte potenziale per la sorveglianza-della PSA in loco e applicazioni diagnostiche-point of-più ampie.
