Nel campo della diagnostica molecolare, la reazione a catena della polimerasi (PCR) è stata a lungo considerata il gold standard per il rilevamento degli acidi nucleici. Negli ultimi anni, le tecnologie di amplificazione isotermica, rappresentate dall'amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA), hanno guadagnato crescente attenzione grazie alla loro velocità, semplicità e idoneità per i test in loco.
Sebbene sia la PCR che la RPA siano metodi di amplificazione degli acidi nucleici, differiscono significativamente nei principi di funzionamento, nei requisiti delle apparecchiature e negli scenari applicativi, rendendo ciascuna tecnologia adatta a diverse esigenze diagnostiche.
1. Principi fondamentali: ciclo termico e amplificazione a temperatura-costante
La PCR è un processo biochimico capace di amplificare una singola molecola di DNA in milioni di copie in un breve periodo di tempo. La reazione si basa su ripetuti cicli termici e si compone di tre fasi principali:
1.Denaturazione (90–95 gradi) – Il DNA a doppio-catena è separato in singoli filamenti.
2. Ricottura (55-65 gradi): i primer si legano alle sequenze target.
3.Estensione (72 gradi) – La DNA polimerasi sintetizza nuovi filamenti di DNA.
Attraverso questi cicli a temperatura-controllata, il DNA bersaglio viene amplificato in modo esponenziale con elevata precisione. Tuttavia, la PCR richiede strumenti complessi per il ciclo termico e in genere richiede 1-2 ore per essere completata.
Al contrario, l’RPA funziona a una temperatura costante di 37–42 gradi, consentendo una rapida amplificazione dell’acido nucleico senza cicli termici. La tecnologia si basa sull'azione coordinata delle proteine ricombinasi, delle proteine che legano il DNA a filamento singolo-e della DNA polimerasi che sposta il filamento per ottenere un'amplificazione del target altamente specifica in condizioni isotermiche.
La DNA polimerasi utilizzata nell'RPA ha attività di spostamento del filamento ma manca di attività di esonucleasi 5'→3'. Durante l'amplificazione, i primer esterni si estendono lungo il filamento modello. Quando incontrano regioni a doppio filamento- sintetizzate dai primer interni, la polimerasi non può degradare il filamento a valle e invece lo sposta, generando nuovi prodotti di amplificazione.
L'intera reazione viene completata a temperatura costante, eliminando la necessità di strumentazioni complesse e consentendo test reali-of-e sul campo-. Incorporando la trascrittasi inversa, l'RPA può essere applicato anche al rilevamento del target dell'RNA.
I risultati dell'amplificazione possono essere analizzati utilizzando più formati di lettura, tra cui rilevamento endpoint, monitoraggio della fluorescenza in tempo reale-, test a flusso laterale e possono essere ulteriormente integrati con i sistemi CRISPR-Cas, microfluidica o sequenziamento di prossima-generazione (NGS) per lo sviluppo di test avanzati.
Scenari applicativi: precisione di laboratorio e test rapidi-in loco
La PCR è diventata una delle tecnologie diagnostiche molecolari più preziose e rimane il gold standard per i test sugli acidi nucleici.
Grazie all'elevata precisione, al rapporto costo-beneficio e alla scalabilità, la PCR è ampiamente utilizzata nella diagnostica clinica, nei laboratori centralizzati, negli istituti di ricerca e nei programmi di screening su larga scala, dove infrastrutture e personale qualificato sono prontamente disponibili.
L'RPA, d'altro canto, offre chiari vantaggi nella diagnostica rapida in-luogo. Con l'amplificazione completata in soli 20 minuti, requisiti minimi di apparecchiature e funzionamento semplice, RPA è ideale per.
- Assistenza sanitaria di base e contesti di emergenza
- Ispezioni doganali e di frontiera
- Screening sul campo delle malattie animali e vegetali
- Test di sicurezza ambientale e alimentare
Se combinato con dispositivi portatili e strisce a flusso laterale, l'RPA consente test molecolari rapidi e affidabili al di fuori dei laboratori tradizionali.
MIRA (Amplificazione Rapida Isotermica Multienzimatica)è la tecnologia di amplificazione isotermica proprietaria di Amp Future. Appartiene alla stessa famiglia tecnica dell'RPA e si ispira ai meccanismi naturali di ricombinazione e riparazione del DNA, utilizzando più enzimi funzionali per ottenere una rapida amplificazione dell'acido nucleico a temperatura costante.
MIRA utilizza un sistema coordinato di cinque enzimi chiave, tra cui elicasi, ricombinasi, proteina legante il DNA a filamento singolo-e DNA polimerasi, per consentire:
- Ampio intervallo di temperature operative: 25 gradi –45 gradi
- Amplificazione rapida: risultati entro 20 minuti
- Elevata sensibilità e specificità
- Maggiore sicurezza e ridotto rischio di contaminazione
MIRA è una tecnologia di amplificazione degli acidi nucleici progettata specificamente per test reali in-luogo e-of-care.
Basandosi sulla piattaforma MIRA, Amp Future ha sviluppato un portafoglio completo di prodotti per POCT molecolare rapido, tra cui:
Agente di rilascio rapido dell'acido nucleico:
L'acido nucleico amplificabile si ottiene entro 5 minuti a temperatura ambiente; bassa inibizione, consentendo il caricamento completo del campione fino a 50 μL; trasporto e stoccaggio a temperatura ambiente, non è richiesta alcuna protezione dalla luce.
Reagente di amplificazione dell'acido nucleico isotermico:
Amplificazione completata in 5-20 minuti, rapida ed efficiente; varie forme di reagenti (polvere liofilizzata, microsfere liofilizzate, ecc.); vari metodi di presentazione dei risultati (elettroforesi, fluorescenza, strisce reattive).
Dispositivi Portatili Miniaturizzati:
Rilevatori isotermici digitali, strumenti di test tascabili-, facili da tenere in una mano, dotati di power bank, che ti liberano dai vincoli del laboratorio e portano sul campo test accurati degli acidi nucleici.
Strisce reattive singole/multiple:
Ottimizzato in base alla metodologia MIRA per una migliore compatibilità; combinato con la tecnologia MIRA, evidenziando la praticità.
Analizzatore di amplificazione degli acidi nucleici completamente automatizzato:
Richiede una sola operazione di caricamento del campione per il rilevamento completamente automatizzato; limite di rilevamento fino a una singola copia; l'amplificazione isotermica e la tappatura automatica riducono il rischio di contaminazione.
Pacchetto-Test rapido in loco:
Test sul--luogo, sempre e ovunque, tutto in un unico pacchetto; completa i test in 30 minuti, accurati e sensibili.
Per ulteriori informazioni sui prodotti o soluzioni, non esitate a contattarci.