《Sviluppo di un nuovo mediato da CAS13A/CAS12ADual "One-Pot" Test di rilevamento per le colture geneticamente modificate Express
Le colture geneticamente modificate sono state ampiamente piantate in tutto il mondo e molti paesi hanno gradualmente migliorato le loro misure normative per garantire la sicurezza delle colture geneticamente modificate. Lo sviluppo di metodi di rilevamento genetico in loco rapidi e accurati è molto importante per l'agricoltura e la biosicurezza e può alleviare le preoccupazioni pubbliche sui prodotti geneticamente modificati.
In questo studio, il gruppo di ricerca ha sviluppato una nuova reazione a una pentola -- Mira a doppia rilevazione combinata con doppio CRISPR (metodo MR-DCA) per il rilevamento simultaneo di CAMV35S e obiettivi genetici NOS nelle colture geneticamente modificate, fornendo un metodo di rilevamento semplice ed efficiente per il rilevamento di colture geneticamente modificate.
Metodi sperimentali
Il doppio prodotto Mira è analizzato da CAS13A e CAS12A Dual System per generare due segnali indipendenti che non interferiscono tra loro, e quindi il colore fluorescente viene letto da uno strumento di illuminazione o da una striscia di prova con due linee T per ottenere il lettore a doppio canale. L'intero processo viene completato in meno di 35 minuti, con un limite di rilevamento a partire da 20 copie.
(Principio di rilevamento MR-DCA di CAMV35S e NOS)
L'intero esperimento è diviso in tre fasi: amplificazione MIRA, reazione CRISPR e due metodi di interpretazione dei risultati.
Il gene CAMV35S è usato come bersaglio di CAS13A e il gene NOS è usato come bersaglio di CAS12A. Sono state progettate rispettivamente due coppie di primer Mira. Il sistema CAS13A riconosce solo l'RNA, quindi è progettata la regione di primer in avanti, che contiene un promotore T7 per la successiva trascrizione e attivazione di CAS13A. Un PAM viene aggiunto al gene NOS. Le aggiunte di cui sopra assicurano che entrambe le proteine CAS13A e CAS12A possano legarsi ai rispettivi CRRNA e non vi è alcuna interferenza o reazione incrociata tra i due sistemi.
Situazione sperimentale
Sensibilità e specificità
Il campione è stato diluito in un gradiente per testare l'intensità di fluorescenza della reazione Mira. È stato scoperto che l'intensità della fluorescenza poteva ancora essere rilevata a una concentrazione di campione di 20 μl. La concentrazione di 20 μl è stata infine selezionata per l'esperimento.
(Diverse concentrazioni di campioni e strisce di prova vengono utilizzate per lo sviluppo del colore e il calcolo della quantificazione dell'intensità)
Per valutare ulteriormente la specificità di MR-DCA, il team di ricerca ha testato campioni misti di animali non transgenici e piante non transgeniche. I risultati hanno mostrato che solo campioni transgenici contenenti CAMV35 e NOS avevano segnali di fluorescenza elevati, mentre l'intensità di fluorescenza di altri campioni era vicina a quella del controllo negativo. MR-DCA può essere utilizzato come una piattaforma di rilevamento di acidi nucleici a doppio target specifico.
24 campioni di colture sono stati testati da MR-DCA. Tra questi, 1, 2, 15, 16, 21 e 22 sono mais transgenici contenenti promotore CAMV35S. 7, 8, 23 e 24 sono riso transgenici resistenti alle malattie contenenti NOS Terminator. 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17 e 18 sono semi transgenici contenenti promotore CAMV35S e NOS Terminator.
(Risultati del test di 24 campioni)
Reazione rapida
Il tempo di reazione è un fattore importante nel rilevamento in loco. Il team di ricerca ha osservato che i segnali di fluorescenza di FAM ed Hex potevano essere rilevati da uno strumento di fluorescenza quando il tempo di reazione era di 10 minuti. Mira combinata con la reazione CRISPR ha anche osservato la fluorescenza gialla dopo 15 minuti.
(Segnale di fluorescenza in diversi tempi di reazione Mira)
(Lo sviluppo del colore delle strisce di prova in diversi tempi di reazione Mira e il calcolo della quantificazione dell'intensità)
Conclusione sperimentale
I risultati sperimentali hanno mostrato che la doppia mira ha una buona specificità e può ottenere accuratamente i prodotti di amplificazione di CAMV35S e NOS. I sistemi CAS13A e CAS12A reagiscono in modo indipendente senza interferire tra loro. Il test MR-DCA può rilevare accuratamente 20 copie a una bassa temperatura di 35 minuti, il che ha un grande valore nel rilevare colture geneticamente modificate sul campo.
Informazioni sull'articolo
Nome del diario: 《Journal of Advanced Research Express
Titolo dell'articolo: 《Sviluppo di un nuovo test a doppio rilevamento "a" One-POT "mediato da CAS13A/CAS12A per le colture geneticamente modificate Express
Fattore di impatto: 11.4
Team di ricerca: Wang Xiaofu, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences