Come misurare la polarizzazione della fluorescenza?

La polarizzazione della fluorescenza (FP) è una potente tecnica utilizzata in vari campi, tra cui biochimica, farmacologia e scienze ambientali. Come fornitore di rilevatori di fluorescenza leader, comprendiamo l'importanza di misurazioni FP accurate e affidabili. In questo post sul blog, esploreremo come misurare la polarizzazione della fluorescenza, dai principi di base alle considerazioni pratiche.

Principi di base della polarizzazione della fluorescenza

La polarizzazione della fluorescenza si basa sul fatto che quando una molecola fluorescente è eccitata dalla luce polarizzata, la luce emessa viene anche polarizzata. Il grado di polarizzazione della luce emessa dipende dal movimento rotazionale della molecola fluorescente durante la durata della fluorescenza. Se la molecola è grande o legata a una macromolecola, il suo movimento di rotazione è limitato e la luce emessa rimane altamente polarizzata. Al contrario, se la molecola è piccola e libera in soluzione, il suo movimento di rotazione è rapido e la luce emessa diventa depolarizzata.

La polarizzazione della fluorescenza è quantificata dal valore di polarizzazione (P), che è definita come la differenza tra le intensità dei componenti polarizzati verticalmente e orizzontalmente della luce emessa divisa per la loro somma:

[P = \ frac {i _ {\ parallel} -i _ {\ perp}} {i _ {\ parallel}+i _ {\ perp}}]

dove (i _ {\ parallelo}) è l'intensità della luce emessa polarizzata verticalmente e (i _ {\ perp}) è l'intensità della luce emessa orizzontalmente polarizzata.

Strumentazione per misurare la polarizzazione della fluorescenza

Per misurare la polarizzazione della fluorescenza, è necessario un rilevatore di fluorescenza dotato di ottica di polarizzazione. La nostra azienda offre una gamma di rilevatori di fluorescenza di alta qualità, incluso ilRilevatore di fluorescenza isotermicoe ilRilevatore di fluorescenza isotermico digitale, che sono specificamente progettati per misurazioni FP accurate e sensibili.

Questi rilevatori in genere sono costituiti dai seguenti componenti:

1. Sorgente luminosa: Una fonte di luce, come una lampada di xeno o un laser, viene utilizzata per generare la luce di eccitazione. La luce dovrebbe essere polarizzata prima che raggiunga il campione.
2. Polarizzatori: I polarizzatori vengono utilizzati per controllare la polarizzazione dell'eccitazione e della luce di emissione. Il polarizzatore di eccitazione viene posizionato nel percorso della luce di eccitazione per garantire che sia polarizzato linearmente. Il polarizzatore di emissione viene posizionato davanti al rivelatore per misurare i componenti polarizzati verticalmente e orizzontalmente della luce emessa.
3. Supporto campione: Un supporto campione viene utilizzato per tenere il campione nel percorso della luce di eccitazione. Dovrebbe essere progettato per ridurre al minimo la dispersione della luce e la fluorescenza di fondo.
4. Rivelatore: Un fotodettore, come un tubo fotomultiplicatore (PMT) o un dispositivo accoppiato (CCD), viene utilizzato per misurare l'intensità della luce emessa. Il rivelatore dovrebbe essere in grado di misurare separatamente le intensità dei componenti polarizzati verticalmente e orizzontalmente.

Setup sperimentale per misurazioni di polarizzazione a fluorescenza

I seguenti passaggi sono coinvolti nella creazione di un esperimento per misurare la polarizzazione della fluorescenza:

1. Seleziona la sonda fluorescente appropriata: Scegli una sonda fluorescente adatta alla tua applicazione. La sonda dovrebbe avere una resa quantica elevata e una lunga durata di fluorescenza.
2. Preparare il campione: Preparare il campione dissolvendo la sonda fluorescente in un tampone adatto. Se si sta studiando un'interazione di legame, aggiungi il ligando o la macromolecola al campione alla concentrazione appropriata.
3. Calibrare lo strumento: Calibrare il rilevatore di fluorescenza secondo le istruzioni del produttore. Ciò può comportare la regolazione del guadagno del rivelatore, l'impostazione delle lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione e misurare la fluorescenza di fondo.
4. Misura i valori di polarizzazione: Posizionare il campione nel supporto del campione e misurare le intensità dei componenti polarizzati verticalmente e orizzontalmente della luce emessa. Calcola il valore di polarizzazione usando la formula sopra menzionata.

Fattori che influenzano le misurazioni della polarizzazione della fluorescenza

Diversi fattori possono influire sull'accuratezza e l'affidabilità delle misurazioni della polarizzazione della fluorescenza:

1. Temperatura: Il movimento rotazionale della molecola fluorescente dipende dalla temperatura. Un aumento della temperatura porta ad un aumento del movimento di rotazione e una diminuzione del valore di polarizzazione. Pertanto, è importante mantenere una temperatura costante durante la misurazione.
2. Viscosità del solvente: La viscosità del solvente influisce sul movimento rotazionale della molecola fluorescente. Un solvente più viscoso limita il movimento rotazionale e aumenta il valore di polarizzazione.
3. Concentrazione della sonda fluorescente: La concentrazione della sonda fluorescente può influire sul valore di polarizzazione. Ad alte concentrazioni, possono verificarsi auto -estinzione e aggregazione della sonda, portando a misurazioni imprecise.
4. Photobleaching: Photobleaching è la distruzione irreversibile della molecola fluorescente da parte della luce di eccitazione. Può portare a una diminuzione dell'intensità della fluorescenza e influire sulla misurazione della polarizzazione. Per ridurre al minimo il fotobleaching, utilizzare una luce di eccitazione a bassa intensità e brevi tempi di esposizione.

Applicazioni di polarizzazione della fluorescenza

La polarizzazione della fluorescenza ha una vasta gamma di applicazioni in vari campi:

1. Scoperta di droghe: FP viene utilizzato per studiare le interazioni vincolanti tra farmaci e loro obiettivi. Misurando il valore di polarizzazione, è possibile determinare l'affinità di legame e la costante di dissociazione del complesso target del farmaco.
2. Saggi immunologici: I test immunologici a base di FP vengono utilizzati per rilevare la presenza di antigeni o anticorpi in campioni biologici. Il legame dell'antigene all'anticorpo - la sonda fluorescente etichettata porta a una variazione del valore di polarizzazione, che può essere utilizzato per quantificare l'analita.
3. Analisi dell'acido nucleico: FP può essere usato per studiare l'ibridazione degli acidi nucleici. Il legame di un oligonucleotide marcato fluorescente alla sua sequenza complementare porta a un cambiamento nel valore di polarizzazione, che può essere utilizzato per rilevare e quantificare l'acido nucleico bersaglio.

Risoluzione dei problemi di misurazione della polarizzazione della fluorescenza

Se si incontrano problemi durante le misurazioni della polarizzazione della fluorescenza, possono essere utili i seguenti suggerimenti per la risoluzione dei problemi:

1. Bassi valori di polarizzazione: Se i valori di polarizzazione sono inferiori al previsto, verificare i fattori come l'alta temperatura, la bassa viscosità del solvente o l'alta concentrazione della sonda fluorescente.
2. Elevata fluorescenza di fondo: L'elevata fluorescenza di fondo può essere causata dalle impurità nel campione o nel solvente o dalla dispersione della luce. Purifica il campione e usa un solvente pulito. Assicurarsi che il supporto campione sia pulito e privo di graffi.
3. Misurazioni incoerenti: Misurazioni incoerenti possono essere dovute a fotobleaching, scarso allineamento dei polarizzatori o fluttuazioni nella fonte di luce. Ridurre al minimo il fotobleaching, controllare l'allineamento dei polarizzatori e assicurarsi che la fonte di luce sia stabile.

Conclusione

La polarizzazione della fluorescenza di misurazione è una tecnica preziosa per studiare le interazioni di legame e la dinamica molecolare delle molecole fluorescenti. In qualità di fornitore di rilevatori di fluorescenza, ci impegniamo a fornire strumentazione di alta qualità e supporto tecnico per aiutarti a ottenere misurazioni FP accurate e affidabili. Che tu stia lavorando nella scoperta di farmaci, nei test immunologici o nell'analisi dell'acido nucleico, il nostroRilevatore di fluorescenza isotermicoERilevatore di fluorescenza isotermico digitalepuò soddisfare le tue esigenze.

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Riferimenti

1. Lakowicz, Jr (2006). Principi di spettroscopia di fluorescenza. Springer Science & Business Media.
2. Szollosi, J., e Damjanovich, S. (2004). Polarizzazione della fluorescenza: una guida pratica. Nei protocolli di corrente nella citometria (pagg. 1 - 17). John Wiley & Sons, Inc.